組織化學(xué)染色
1.室溫脫蠟、水化:二甲苯一號10分鐘、二甲苯二號8分鐘、二甲苯三號8分鐘、無水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次,PBS3分鐘*3次。
2.熱抗原修復(fù),換新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修復(fù)液(一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液),用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然后將切片放入熱鍋中15分鐘,最后自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次,蒸餾水3分鐘*2次。
3.免疫組化筆畫圈:取出組織,甩干水分,可用吸水紙吸干水珠。用組化筆畫圈圍住組織,圓圈完整。
4.滅活內(nèi)源酶活性:將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過氧化氫(二抗試劑盒中A一滴或者50微升,劑量詳見二抗說明書),室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次,蒸餾水水洗三分鐘。
5.封閉非特異性位點:甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液(二抗試劑盒B一滴或者50微升),放入濕盒內(nèi),室溫10分鐘。
6.甩掉封閉液,滴加一抗蓋住組織,然后放入濕盒內(nèi)4攝氏度過夜。(一抗?jié)舛纫娍贵w說明書,提前稀釋后分裝,并在負二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定,看組織面積大小,xxxxx癌組織一張20微升左右。
7.第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復(fù)溫30分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水洗滌三分鐘。
8.甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗試劑盒C)一滴或者50微升,室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
9.每張片子滴加一滴或者50微升鏈霉菌抗生物su-過氧化物酶溶液(二抗試劑盒D),室溫孵育10分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
10.每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液,顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合適即可終止染色,自來水沖洗。
11.蘇木素復(fù)染,1-2分鐘,細胞核變藍色即可終止,自來水或者PBS沖洗反藍(可用0.5%氨水反藍)。
12.1%鹽酸酒精分化3秒,自來水沖洗三分鐘。
13.脫水:70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無水乙醇4分鐘、二甲苯一號3分鐘、二甲苯二號3分鐘。
14.涼干片子后滴加適量中性樹膠封片,蓋上蓋玻片,小心氣泡。晾干半天即可。
15.顯微鏡下拍照。
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